Secara umum HPLC merupakan teknik pemisahan yang menggunakan fase diam dan fase gerak untuk memisahkan komponen-komponen sampel. Berdasarkan perbedaan fase diam dan fase gerak yang digunakan, HPLC dapat dibedakan menjadi beberapa jenis diantaranya sebagai sebagai berikut.
1. HPLC Fase Normal (Normal Phase HPLC)
Pada jenis HPLC ini, fase diam bersifat polar dan fase gerak bersifat non polar. Pemisahan terjadi karena komponen sampel yang bersifat lebih polar akan berinteraksi lebih kuat dengan fase diam (polar) sehingga membutuhkan waktu lebih lama untuk melewati kolom dibandingkan dengan komponen sampel yang bersifat kurang polar.
Gambar 1: Normal Phase HPLC
Fase diam yang digunakan biasanya berisikan silika murni atau gugus senyawa organik seperti amino atau siano yang terikat pada basis silika. Sedangkan fase geraknya biasanya merupakan senyawa non polar seperti heksana atau heptana yang sedikit dicampur dengan senyawa polar seperti metanol, etanol, ataupun isopropanol. Aplikasi HPLC fase normal meliputi:
- Analisis senyawa-senyawa polar seperti asam amino, gula, dan vitamin
- Analisis senyawa-senyawa yang dapat dipolarisasi seperti senyawa-senyawa aromatik
- Analisis senyawa-senyawa yang dapat membentuk kompleks dengan gugus polar seperti senyawa-senyawa logam
2. HPLC Fase Terbalik (Reverse Phase HPLC)
Pada jenis HPLC ini, fase diam bersifat non-polar dan fase gerak bersifat polar. Pemisahan terjadi karena komponen sampel yang bersifat kurang polar akan berinteraksi lebih kuat dengan fase diam (non polar) sehingga membutuhkan waktu lebih lama untuk melewati kolom ketimbang komponen sampel yang bersifat lebih polar.
Gambar 2: Reverse Phase HPLC
Fase diam yang digunakan pada fase ini biasanya merupakan hidrokarbon alkil non polar seperti rantai C-8 atau C-18 yang terikat pada basis silika. Kolom C18 atau Oktadesil Silika (ODS) merupakan jenis yang paling populer digunakan dalam HPLC. Fase gerak yang kerap digunakan pada fase terbalik adalah campuran air dengan pelarut polar lain seperti Metanol, Asetonitril, atau Tetrahidrofuran. Aplikasi HPLC fase terbalik meliputi:
- Analisis senyawa-senyawa non polar seperti hidrokarbon, lipid, dan steroid
- Analisis senyawa-senyawa yang dapat dipolarisasi seperti senyawa-senyawa aromatik
- Analisis senyawa-senyawa yang dapat membentuk kompleks dengan gugus non polar seperti senyawa-senyawa logam
3. HPLC Eksklusi Ukuran (Size-exclusion HPLC)
Pada jenis HPLC ini, pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran molekul masing-masing komponen sampel. Kolom yang digunakan berisikan packing material yang memiliki ukuran pori yang sudah diatur. Komponen sampel dengan ukuran molekul yang lebih kecil akan terserap masuk ke dalam pori packing material sehingga membutuhkan waktu yang lebih lama untuk melewati kolom dibanding dengan komponen dengan ukuran molekul yang besar. Aplikasi HPLC eksklusi ukuran meliputi:
- Analisis ukuran molekul protein
- Analisis ukuran molekul polimer
- Analisis ukuran molekul DNA
Gambar 3 Size-exclusion HPLC: Molekul yang lebih kecil akan terperangkap masuk sehingga melewati kolom lebih lama
4. HPLC Pertukaran Ion (Ion Exchange HPLC)
Jenis HPLC ini digunakan untuk sampel yang bersifat ionik atau dapat diubah menjadi ionik. Fase diamnya memiliki permukaan bermuatan ionik yang berlawanan dengan sampel. Semakin kuat muatan komponen sampelnya, maka komponen tersebut akan tertarik pada permukaan fase diam sehingga akan membutuhkan waktu lebih lama untuk melewatinya. Aplikasi HPLC pertukaran ion meliputi:
- Analisis asam amino dan protein
- Analisis karbohidrat
- Analisis antibiotik
Ion Exchange Chromatography
Kesimpulan:
HPLC merupakan teknik pemisahan yang memiliki berbagai macam aplikasi dalam berbagai bidang. Pemilihan jenis HPLC yang tepat tergantung pada karakteristik sampel yang akan Anda analisis.
Baca juga: CD44 3′-Untranslated Region Meningkatkan Sensitivitas Sel NK Hati
Advisains dapat memfasilitasi diskusi lebih lanjut mengenai product HPLC dari brand TOSOH. Sampaikan Kebutuhan Riset Anda Tim advisor spesialis kami sangat antusias mendukung keberhasilan riset dan aplikasi rutin Anda. Chat sekarang (+62 817 9154 607/info@advisains.id).
