Tahapan Lengkap Workflow Next Generation Sequencing (NGS)

Next Generation Sequencing (NGS) adalah teknologi yang memungkinkan pengurutan genom dalam jumlah besar secara cepat, efisien, dan dengan biaya yang lebih rendah dibandingkan metode tradisional seperti Sanger sequencing. Berikut adalah penjelasan lengkap mengenai tahapan workflow NGS berdasarkan tahapan sample preparation, sequencing, dan data analysis rekomendari dari Advisains.

Sample Preparation pada Workflow NGS

Persiapan sampel merupakan langkah awal yang sangat penting dalam workflow NGS. Proses ini memastikan bahwa DNA atau RNA dari sampel yang digunakan memiliki kualitas tinggi sehingga hasil sequencing lebih akurat.

• Sample Collection: Sampel biologis diambil dari berbagai sumber, seperti darah, jaringan, atau sel. Kualitas dan pengelolaan sampel sangat penting untuk mencegah kontaminasi yang dapat mempengaruhi hasil sequencing. Kami merekomendasikan Anda untuk tahap ini menggunakan kit sample collection dari Macherey-Nagel.
• Sample Grinding, Lysis, & Homogenization: Sampel sel atau jaringan dihancurkan dan dihomogenisasi untuk memecah struktur biologis dan melepaskan kandungan DNA atau RNA. Proses lisis membantu menghancurkan membran sel dan nukleus, memungkinkan ekstraksi DNA atau RNA yang efisien. Kami merekomendasikan Anda untuk tahap ini menggunakan kit dan instrument untuk sample homogenizing, grinding and lysing dari Bertin Technologies.
• DNA/RNA/Genomic Isolation: Pada tahap ini, materi genetik (DNA atau RNA) diisolasi dari komponen seluler lainnya. Ekstraksi dilakukan menggunakan kit komersial yang dirancang untuk memurnikan DNA atau RNA dari sampel biologis. Kualitas dan kuantitas DNA/RNA yang dihasilkan harus dinilai menggunakan metode seperti spektrofotometer atau fluorometer, untuk memastikan bahwa materi genetik tersebut layak untuk sequencing. Kami merekomendasikan Anda untuk tahap ini menggunakan kit ekstraksi soil sample dari Macherey-Nagel.

NGS (Next Generation Sequencing)

Proses sequencing dimulai dengan mempersiapkan fragmen DNA atau RNA, melakukan amplifikasi, dan menyiapkan library yang siap untuk diurutkan. Berikut adalah tahapan NGS:

• DNA Fragmentation: DNA/RNA yang diisolasi kemudian dipecah menjadi fragmen kecil (biasanya 200-600 bp) menggunakan metode fisik (seperti sonikasi) atau enzimatik. Fragmen-fragmen ini akan lebih mudah diurutkan oleh mesin NGS.
• DNA Amplification: Setelah fragmentasi, DNA diperbanyak menggunakan polymerase chain reaction (PCR) atau metode amplifikasi lainnya. Ini memastikan bahwa jumlah DNA yang cukup tersedia untuk sequencing dan memperkuat sinyal saat proses sequencing berlangsung.
• Library Preparation: Pada tahap ini, adaptor spesifik ditambahkan ke ujung fragmen DNA yang telah dipotong. Adaptor ini memungkinkan fragmen DNA menempel pada platform sequencing dan membantu proses identifikasi sampel dalam multiplexing (pada saat banyak sampel diurutkan secara bersamaan).
• Sample QC (Quality Control): Kualitas library yang telah dibuat dievaluasi menggunakan alat seperti Agilent Bioanalyzer atau Qubit untuk memastikan bahwa fragmen DNA berada pada rentang panjang yang diinginkan dan konsentrasi cukup tinggi untuk sequencing. Kontaminasi atau kualitas DNA yang rendah dapat mempengaruhi hasil sequencing.
• Sequencing: Tahap inti dari NGS. Mesin NGS mengurutkan fragmen DNA untuk menghasilkan urutan basa nukleotida. Ada beberapa teknologi yang digunakan, seperti Illumina, Ion Torrent, dan Oxford Nanopore Technology (ONT). Teknologi yang digunakan akan menentukan metode pengurutan yang dipakai, tetapi semuanya pada dasarnya menghasilkan data urutan genom dalam jumlah besar (reads).

Tahap Data Analysis

Setelah proses sequencing, data yang dihasilkan harus diproses dan dianalisis menggunakan berbagai alat bioinformatika. Tahap ini sangat penting untuk mengekstraksi informasi yang berguna dari data mentah.

• Sequencing Data: Data urutan yang dihasilkan oleh mesin NGS berupa file mentah dalam format FASTQ. File ini mengandung urutan basa nukleotida beserta informasi kualitas dari setiap urutan yang dihasilkan. Data mentah perlu diproses untuk menghilangkan urutan berkualitas rendah dan adaptor yang tersisa.
• Bioinformatics Tools: Setelah data diproses, alat bioinformatika digunakan untuk analisis lebih lanjut. Berikut beberapa tahapan penting:
• Quality Control: Memastikan bahwa data sequencing memenuhi standar kualitas tertentu dengan tools seperti FastQC. Hal ini termasuk memeriksa kualitas tiap basa serta potensi kontaminasi adaptor.
• Alignment: Reads yang telah dibersihkan disejajarkan dengan referensi genom menggunakan alat seperti Burrows-Wheeler Aligner (BWA) atau Bowtie. Ini membantu dalam identifikasi variasi genetik atau mutasi.
• Variant Calling: Setelah alignment, analisis lanjutan dilakukan untuk mengidentifikasi variasi genetik seperti SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) atau indel (insertions and deletions). Alat seperti GATK atau SAMtools sering digunakan untuk tugas ini.
• Annotation: Variasi yang ditemukan dianotasi dengan informasi fungsional, yang bisa memberikan wawasan apakah variasi tersebut berhubungan dengan penyakit atau karakteristik tertentu.
• Visualization: Hasil akhirnya divisualisasikan menggunakan alat seperti IGV (Integrative Genomics Viewer) untuk menganalisis pola variasi genomik lebih lanjut.

Workflow NGS melibatkan tiga tahap utama: persiapan sampel, sequencing, dan analisis data. Setiap tahap harus dilakukan dengan teliti untuk menghasilkan data yang akurat dan berkualitas tinggi. Dengan perkembangan teknologi sequencing dan bioinformatika, NGS kini memainkan peran sentral dalam berbagai bidang seperti riset genetika, diagnostik klinis, dan pengembangan terapi berbasis genom.

Advisains dapat memfasilitasi diskusi lebih lanjut mengenai NGS. Sampaikan Kebutuhan Riset Anda Tim advisor spesialis kami sangat antusias mendukung keberhasilan riset dan aplikasi rutin Anda. Maka, jangan ragu untuk chat sekarang (+62 817 9154 607/info@advisains.id).

Baca juga:
– Teknologi Terbaru CGT: Solusi Efektif dari CliniMACS Prodigy®